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Favoriser la croissance des plantes grâce à des bactéries.

Jeudi 17 janvier 2013. Peter Mergaert, Institut des Sciences du Végétal (CNRS Gif)

jeudi 25 juillet 2013, par Séverine

Pour ce Jeudi de la Recherche, nous avons été accueillis à l’Institut des Sciences du Végétal sur le campus de Gif, par Peter Mergaert, Directeur de Recherches au CNRS. Son équipe travaille sur la croissance de plantes et plus particulièrement leurs interactions avec les bactéries de leur environnement.

Des bactéries utiles.

Les bactéries ont souvent mauvaise réputation, associées qu’elles sont aux maladies. Mais de nombreuses bactéries, avec qui nous vivons quotidiennement, nous sont en fait bénéfiques : situées dans la bouche, l’intestin, la peau, le système respiratoire ou les muqueuses, elles aident à la digestion, la vascularisation ou renforcent notre système immunitaire. Il en est de même pour les plantes. La portion du sol autour des racines de la plante, la rhizosphère, est un des lieux avec la plus grande biodiversité microbienne au monde, selon Peter Mergaert ! Elle est composée, entre autres, de bactéries qui peuvent vivre en symbiose avec la plante afin de l’aider à obtenir les nutriments dont elle a besoin. Ainsi, le manque d’azote, de phosphore ou encore de calcium sont des facteurs limitants pour la croissance de la plante. Or l’azote est présent directement dans le sol (nitrates) mais aussi dans l’air sous forme de diazote (N2 ). Mais la plante seule ne peut utiliser le diazote, faute de posséder les enzymes adéquates. Quelques plantes, comme les légumineuses, s’associent alors à des bactéries de leur rhizosphère pour gagner cette faculté.

Racines de Medicago truncatula (une légumineuse) sur lesquelles se sont développées des nodosités dans le cadre d’une interaction/symbiose avec des rhizobia,

Les bactéries fournissent donc de l’azote à la plante qui l’utilise pour sa croissance. En retour, la plante fournit des molécules organiques (à base de carbone) indispensables à la croissance de la bactérie. Cette symbiose fonctionne grâce à des nodosités présentes sur les racines de la plante, juste sous la surface, et dans lesquelles s’installent les bactéries symbiotiques « rhizobia ».

Ainsi les légumineuses (soja, arachide, haricot, fèves, luzerne…), qui représentent 27% de la production agricole mondiale, font l’objet d’un intérêt particulier en agriculture. Elles peuvent grâce à cette interaction enrichir le sol en azote pour les cultures suivantes. Les rhizobia peuvent être naturellement présents dans le sol ou être apportés artificiellement notamment par un enrobage des graines avec des bactéries. Mais la grande majorité des plantes, notamment le blé ou le riz, n’ont pas la capacité d’interagir avec les rhizobia. La recherche à l’ISV s’attache à comprendre pourquoi : elle doit pour cela étudier comment cette symbiose fonctionne en détail.

Dans la nature...

Tout d’abord, détaillons ensemble ce principe de symbiose. D’une part, grâce à la photosynthèse, la plante produit des composés carbonés dont le malate qu’elle donne à la bactérie. Celle-ci utilise le malate pour produire de l’ATP, une molécule présente dans tous les êtres vivants qui permet de véhiculer l’énergie nécessaire aux réactions chimiques de la cellule. D’autre part, la bactérie récupère le diazote N2 de l’air diffusé dans le sol et, grâce à l’ATP, produit de l’ammoniac NH3 assimilable par la plante. Le cœur de la symbiose réside dans la nitrogénase : cette enzyme, produite par la bactérie, permet de récupérer les électrons indispensables à la réduction chimique du diazote N2, c’est-à-dire la conversion du N2 en NH3 . Cependant, cette nitrogénase est inactivée par l’oxygène donc ce mécanisme nécessite un milieu pauvre en oxygène. Cela est assuré par une protéine produite par la plante et capable de fixer l’oxygène : la leghémoglobine. Cette protéine, semblable à l’hémoglobine présente dans notre sang, est responsable de la couleur interne rouge des nodosités (elles apparaissent rosées de l’extérieur).

... et par l’Homme

Pour fabriquer industriellement des engrais, on utilise le procédé Haber-Bosch qui repose sur la réaction. Ce procédé industriel permet actuellement de produire la moitié des besoins en protéines de la population humaine. Il a valu à ses inventeurs deux Prix Nobel en 1918 et 1931. Cependant, il représente un coût énergétique énorme : il nécessite en effet des pressions de 100 à 250 bars et des températures allant jusqu’à 550°C (alors que la réaction « in vivo » a lieu à température et pression ambiante !) et représente 1% à 2% de la consommation mondiale d’énergie. L’étape la plus critique reste la production d’hydrogène H2 nécessaire à la réaction. Le procédé génère aussi des déchets.

Prolifération de l’algue "Ulva lactuca" dans la baie de Lannion

Enfin, les engrais à base d’ammoniac contribuent au réchauffement climatique par la dénitrification des sols (le processus naturel est amplifié par l’ajout d’ammoniac : du diazote est rejeté dans l’atmosphère, la quantité de nitrate diminue dans les sols tandis que les quantités de NO et de NO2 augmentent), à la pollution des nappes phréatiques et à l’eutrophisation des systèmes aquatiques (facilitant la prolifération d’algues). Une meilleure compréhension de la symbiose devrait permettre de diminuer les apports d’engrais en agriculture et ainsi de limiter la facture énergétique imputable à la production d’engrais chimiques.

Les recherches à l’ISV

Les racines des plantes sont recouvertes en partie de poils absorbants, utilisés notamment pour récupérer les nutriments du sol. Ces poils sont impliqués dans le processus qui permet à la bactérie et à la plante de s’indiquer leur présence respective. Ainsi, lorsqu’ une plante subit une carence en azote, elle sécrète un cocktail de substances appelées flavonoïdes qui est reconnu par les bactéries Rhizobia présente dans la rhizosphère. Les bactéries répondent alors en sécrétant des facteurs de nodulation, dits facteurs Nod et la plante peut commencer à former les nodosités dont elle va avoir besoin pour accueillir les bactéries : les poils absorbants dévient et se recourbent autour d’une colonie bactérienne qui va pénétrer les cellules de la plante via un cordon d’infection. La plante répond alors aussi aux facteurs Nod en déclenchant des divisions cellulaires qui mènent à la formation d’un début de nodosité. Lorsque le cordon d’infection atteint ce « primordium », il relâche les bactéries dans les cellules végétales, entourées d’une membrane provenant de la cellule hôte. La bactérie devient bactéroïde et convertit l’azote au sein des cellules symbiotiques de la nodosité.

© P. Mergaert

Les Différentes étapes de la formation d’une nodosité (I)L’interaction commence par la colonisation des poils racinaires (rouge dans les photos) par les bactéries (vert). (II et III) Les bactéries induisent la déformation des poils et ensuite les infectent par la formation d’une structure très spécifique qu’on appelle un cordon d’infection. (IV) Les cellules internes de la racine commencent à se diviser et initient la formation de la nodosité. Les cordons d’infection contenant les bactéries se dirigent vers la nodosité en formation et relâchent les bactéries dans les cellules de la nodosité. (V)Une fois complètement formée, la nodosité est entièrement remplie avec des bactéries (vert) qui fixent l’azote. (VI) Agrandissement d’une cellule de la nodosité avec à l’intérieur des milliers de bactéries (bleu).

Comprendre la mise en place de ces nodosités au niveau moléculaire nécessite l’analyse du génome de la plante (5.108 bases et jusqu’à 50 000 gènes codant autant de protéines) et de la bactérie (5.106 à 107 bases et 5000 gènes) pour déterminer les gènes mis en cause. Pour cela, l’ISV dispose d’outils permettant l’étude des génomes et de l’expression des gènes.

La mutagenèse aléatoire est une technique permettant d’étudier un génome. Cela consiste à provoquer aléatoirement la mutation des gènes et à déterminer ensuite quelles mutations ont inactivé les gènes intéressants et empêchent la symbiose. Cette mutagenèse est le résultat d’agents chimiques, d’une exposition aux radiations ou de l’insertion d’un transposon (une courte séquence d’ADN permettant ici d’interrompre un gène). Une telle étude nécessite plusieurs milliers de plantes, chacune portant une mutation distincte, mais le résultat est facile à observer : lorsque la symbiose est empêchée, la plante pousse beaucoup moins bien ! L’étude de l’expression des gènes s’intéresse non aux gènes eux-mêmes mais aux protéines produites par ces gènes via un ARN messager. Une cellule possède tous les gènes associés à toutes les protéines de l’organisme mais ne produit que les protéines qui seront utiles à sa fonction propre. Pour identifier les ARN et protéines spécifiques des nodosités, il suffit alors de lister les protéines (ou ARN messagers) présentes dans les nodosités et dans le reste de la plante et de les comparer : les chercheurs utilisent pour cela des spectromètres de masse et font du séquençage. On peut même alors identifier les protéines ou ARNs spécifiques des différentes cellules composant les nodosités.

Quelques résultats

Parmi les nombreux résultats qu’ils ont pu obtenir, les chercheurs de l’ISV ont notamment identifié les gènes « Nod » de la bactérie qui permettent la synthèse du facteur Nod signalant à la plante la présence de la bactérie. Ces gènes ne sont pas exprimés si la plante n’est pas présente dans l’environnement proche de la bactérie. De même, ils ont mis en évidence le schéma de signalisation consécutif à la reconnaissance de ce facteur Nod et qui mène à la formation des nodosités. D’une part, l’épiderme (les poils absorbants) signalent la présence des bactéries aux noyaux cellulaires qui activent les gènes responsables de la déformation des poils (permettant l’infection) grâce à un signal formé de pics de calcium très rapides. D’autre part, le cortex, tissu situé au centre de la racine, démarre les divisions cellulaires formant l’organe primitif de la nodosité dès réception du facteur Nod. Enfin, les chercheurs de l’ISV ont aussi montré que les bactéries relâchées dans la nodosité sont morphologiquement et physico-chimiquement modifiées par rapport aux bactéries simplement présentes dans la rhizosphère de la plante. Des gènes « NCR » ne sont transcrits que dans les nodosités et aident à la différentiation des bactéries en bactéroïdes. Ces gènes agissent en fait un peu comme notre propre système immunitaire.

Visite des laboratoires

Nous avons ensuite eu la chance de pouvoir rencontrer quelques membres des équipes de recherche : Ibtissem Guefrachi, Patricia Durand, Benjamin Gourion et Benoît Alunni qui nous ont expliqué leurs activités quotidiennes.

Microscope

Les premières nous ont montré comment elles étudient les nodosités grâce à un microscope photonique confocal. Il faut d’abord obtenir des tranches de nodosités très fines (d’épaisseur inférieure à 70 μm). Pour cela, on place les nodosités dans un gel d’agarose et on utilise un instrument de précision pour trancher le gel (un vibratome) : c’est un processus lent et délicat. Ensuite, le microscope à balayage laser permet de mettre en évidence d’une part l’auto-fluorescence naturelle des cellules, et d’autre part les cellules contenant des bactéries vivantes (identifiées préalablement marquées par un colorant vert) ou diverses structures (bactéries mortes ou noyaux cellulaires), colorées en rouge.

© P. Mergaert

Une nodosité vue par un microscope confocal. Sous le microscope, les bactéries émettent une lumière verte grâce à la protéine GFP (Green Fluorescent Protein). Les noyaux des cellules végétales sont colorées en rouge grâce à l’iodure de propidium, colorant de l’ADN. A gauche on voit une section d’une nodosité entière. La nodosité contient des milliers de cellules végétales qui sont remplies de bactéries. A droite on a zoomé sur quelques cellules de la nodosité et on peut distinguer les bactéries qui apparaissent comme des bâtons.

Biologie moléculaire Nous avons ensuite nous découvert l’étude de la fixation d’azote par la nitrogénase, la préparation des échantillons (appelés « inocula ») de bactéries pour les plantes et leur étude des ADN extraits. Par commodité, on n’étudie pas en laboratoire la réaction naturelle de fixation d’azote par la nitrogénase mais une réaction similaire, également catalysée par la nitrogénase : il est ainsi préférable d’utiliser de l’acétylène C2 H2 qui est converti en éthylène C2 H4 selon la réaction Ainsi, pour savoir s’il y a symbiose (et donc production de nitrogénase), il suffit de voir si la plante mutée que l’on étudie est capable de convertir l’acétylène. Pour cela, les chercheurs utilisent la chromatographie en phase gazeuse : après avoir détecté les deux signatures (pics) des gaz purs séparés, ils effectuent une mesure sur un tube fermé contenant une plante mutée et une quantité connue d’acétylène. La taille relative des pics d’acétylène (substrat) et d’éthylène (produit) révèle l’efficacité de la réaction et fournit des données quantitatives. Ainsi, si la plante sauvage fournit un certain rapport Rs des pics, toute plante fournissant un rapport R>Rs sera plus efficace et aura donc subi une mutation favorable et toute plante fournissant un rapport inférieur à Rs aura subi une mutation défavorable. Plus il y a d’éthylène produit, plus la symbiose est efficace.

D’autre part, pour effectuer des tests de nodulation qui soient comparables entre eux, il faut fournir à chaque plante la même quantité de bactéries. Pour cela, les chercheurs effectuent des cultures bactériennes dans un milieu de culture (liquide) adéquat qu’ils passent ensuite dans une centrifugeuse. Ils obtiennent ainsi une précipitation au fond du tube appelée culot bactérien. Ce culot est ensuite rincé à l’eau afin que la plante ne puisse détecter aucune autre substance que la bactérie (dans le cas contraire, certains éléments du milieu de culture inhiberaient la symbiose en stimulant l’immunité de la plante). Afin de standardiser l’inoculum, la quantité de bactéries présentes dans le culot rincé est déduite d’une mesure d’absorbance par la lumière. L’inoculation est faite avec un taux de 108 bactéries/mL d’eau.

Enfin, une dernière manipulation qui nous a été présentée consiste en l’amplification de l’ADN extrait des bactéries ou des plantes étudiées, afin d’obtenir de grandes quantités d’ADN à étudier. Il s’agit d’une PCR pour Réaction en Chaîne par Polymérase (de l’anglais « Polymerase Chain Reaction ») : après avoir séparé les deux brins de l’ADN extrait (à 95°C), on utilise des amorces nucléotidiques constituées des bases nucléotidiques A, T, G, C complémentaires du gène que l’on veut copier. Ces amorces vont alors s’hybrider sur la matrice d’ADN (à 55-60°C). L’ADN polymérase (enzyme qui fonctionne encore à 72°C) produira alors une copie de ce gène en polymérisant des bases nucléotidiques (A, T, G, C) complémentaires de la matrice. De nombreux cycles (95°/55°/72°) permettent alors d’obtenir un grand nombre de copies. Une analyse par électrophorèse permet ensuite de vérifier que le processus s’est bien passé en vérifiant sur une table fluorescente que l’ADN copié migre à la distance attendue pour le fragment d’ADN original sur la table fluorescente. Pour cela, on prend soin d’ajouter un agent intercalant de l’ADN qui fluoresce sous UV (le bromure d’éthidium ou BET).

Serres de l’ISV

Serres Nous avons enfin pu visiter les serres et chambres de culture dans lesquelles sont cultivées les plantes sauvages ou mutantes, à l’air libre en pots ou in vitro. Certaines de ces chambres permettent la culture de plantes et d’agents pathogènes, de façon entièrement automatisée. Dans celles que nous avons pu visiter, de grandes armoires, éclairées selon une alternance jour/nuit, renferment de nombreuses plantes à divers stades de développement. Les serres présentent une certaine variété de plantes cultivées à l’air libre, bien alignées dans leur pot. Une blouse de couleur distincte est nécessaire pour chaque zone, afin de limiter à la fois la dispersion à l’extérieur des semences des plantes mutées ou des agents pathogènes et l’exposition des plantes à tout ce que l’on pourrait amener de l’extérieur.

En guise de conclusion, Peter Mergaert a tenu à préciser que ces travaux sont effectués dans un cadre national (des équipes réalisent des travaux similaires à Paris, Toulouse, Sophia Antipolis...) et international innovant et productif. En effet, ces recherches ont de nombreuses applications : l’étude de l’intérêt des rotations de culture (entre par exemple du riz et des légumineuses), le transfert de ces propriétés à d’autres plantes n’ayant pas naturellement cette capacité de symbiose, l’étude de la compétition entre toutes les bactéries présentes dans la rhizosphère et l’adaptation des engrais au sol des cultures n’en sont que quelques exemples.